В ГБУ Брянской области «Клинцовская зональная ветлаборатория» поступают пробы для исследования на стафилококки. В основном пробы молочной продукции (молока питьевого пастеризованного, творога, масла сливочного) и рыбы живой. Исследования проводятся по ГОСТ 30347 - 2016 "Молоко и молочная продукция. Методы определения Staphylococcus aureus" ГОСТ 31746-2012 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus". Для подтверждения правильности применения метода испытаний специалисты участвовали в проверке квалификации путем проведения межлабораторных сличительных испытаний. Результаты были признаны удовлетворительными.
Коагулазоположительные стафилококки: грамположительные, каталазоположительные микроорганизмы, которые образуют типичные и/или атипичные колонии на (в) селективно-диагностической питательной среде, дающие положительную реакцию на коагулазу или специфичную для кроличьей плазмы реакцию на агаре с кроличьей плазмой и фибриногеном.
Staphylococcus aureus (S. аureus): коагулазоположительные стафилококки, образующие ацетоин и ферментирующие мальтозу в аэробных условиях.
Метод определения количества S. aureus с предварительным обогащением.
Метод основан на высеве навески продукта и (или) его разведения в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, учете положительных пробирок (колб), пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus.
Из навески продукта готовят ряд десятикратных разведений так, чтобы можно было определить наличие или отсутствие S. aureus в определенной массе (объеме), указанной в нормативном или техническом документе на конкретный продукт. Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см 3 в пробирки или колбочки с солевым бульоном. Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1:10. Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37±1)°С в течение 24-48 ч. Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по помутнению среды.
Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне к коагулазоположительным стафилококкам, для получения изолированных колоний делают пересев петлей из бульона на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркер, желточно-солевого агара или молочно-солевого агара по прошествии 24 ч инкубирования из предположительно положительных пробирок; все оставшиеся пробирки - после 48 ч. Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37±1)°С в течение 24 - 48 ч. После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.
Подтверждение принадлежности типичных и атипичных колоний.
Для подтверждения принадлежности типичных и атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам отбирают не менее пяти типичных и/или атипичных колоний с каждой чашки Петри. Для подтверждения принадлежности отобранных типичных и атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам пересевают каждую отобранную колонию отдельно на поверхность скошенного питательного агара. Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С в течение (24±3) ч.
Для подтверждения принадлежности к коагулазоположительным стафилококкам у выросших и отобранных микроорганизмов определяют отношение к окраске по Граму; способность образовывать каталазу и способность коагулировать плазму крови кролика.
Коагулазоположительные стафилококки окрашиваются по Граму положительно (в темно-фиолетовый цвет), имеют шарообразную форму и располагаются чаще (но не всегда) в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда.
Определение способности микроорганизмов образовывать каталазу.
На колонию микроорганизмов, взятую с поверхности питательной среды или извлеченную из нее, помещенную на предметное стекло и выдержанную на воздухе в течение 30 мин, пипеткой наносят каплю 3%-ного раствора перекиси водорода. Если через 30 - 60 с на стекле появляются пузырьки газа, то считают, что они образовались в результате разложения перекиси водорода каталазой, образуемой микроорганизмами. Коагулазоположительные стафилококки образуют каталазу.
Определение способности коагулировать плазму крови кролика
Способность коагулировать плазму крови кролика определяют у микроорганизмов, окрашивающихся положительно и образующих каталазу.
В пробирку с 0,5 см 3 разведенной кроличьей плазмы вносят петлю суточной агаровой культуры и тщательно перемешивают. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, а в другую засевают контрольный штамм S. aureus (коагулазоположительный стафилококк). Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температуре (37±1)°С в течение 3 - 6 ч. Если по истечении 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то пробирки оставляют в термостате до 24 ч. Если через 24 ч плазма не свернулась, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.
При определении коагулазной активности реакцию считают отрицательной, если в плазме не образуются отдельные нити или сгустки или если в плазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на один плюс).
При определении коагулазной активности реакцию считают положительной, если:
+ + + + - сгусток плотный; + + + - сгусток, имеющий небольшой отсек; + + - сгусток в виде взвешенного мешочка.
Все три варианта являются положительным результатом. При получении положительной реакции считают, что в посевах обнаружен коагулазоположительный стафилококк.
Оценка результатов подтверждения принадлежности характерных колоний к коагулазоположительным стафилококкам
Если при испытании типичных и атипичных колоний в них обнаружены грамположительные кокки, образующие каталазу, способные коагулировать плазму крови, то считают, что выявленные микроорганизмы относятся к коагулазоположительным стафилококкам.
Подтверждение принадлежности выявленных коагулазоположительных стафилококков к S. Aureus.
Принадлежность выявленных коагулазоположительных стафилококков к S. aureus проводят по определению их способности образовывать ацетоин и ферментировать мальтозу в аэробных условиях.
Определение способности образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера).
Культуру высевают в пробирки со средой Кларка. Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С в течение 48 ч.
После инкубирования посевов к 1 см 3 отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см 3 раствора I-нафтола и 0,2 см 3 раствора гидроокиси калия. После добавления каждого реактива пробирку встряхивают. Появление розового окрашивания через 15 - 60 мин указывает на положительную реакцию. S. aureus образует ацетоин.
Определение способности ферментации мальтозы в аэробных условиях.
Исследуемые культуры высевают уколом петлей в среду Гисса с мальтозой и инкубируют при температуре (37±1)°С в течение 48 ч. Изменение цвета среды указывает на положительную реакцию. S. aureus ферментирует мальтозу в аэробных условиях.
Представление результатов определения количества S. aureus выражают: "обнаружены" или "не обнаружены" в х см 3 или в х г продукта.